Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
- включение стадии предварительного фокусирования,
- использование автоматизированного оборудования,
- использование гелей агарозы.
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ФОКУСИРОВАНИЯ
Если используются альтернативные способы по отношению к подробной методике, они должны быть валидированы. Для валидации разделения могут быть использованы следующие критерии:
- образование устойчивого градиента рН с желаемыми характеристиками, оцениваемого, например, с помощью окрашенных маркеров рН с известными величинами изоэлектрических точек,
- сравнение с электрофореграммами, полученными при использовании химического образца сравнения для исследуемого образца,
- любые другие критерии валидации, указанные в монографии.
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ОБЩЕЙ МЕТОДИКИ
Изменения общей методики, необходимые при анализе некоторых веществ, могут быть подробно описаны в частных статьях. Они включают:
- добавление в гель мочевины (обычно 3 M концентрации достаточно для поддерживания белка в растворённом состоянии, но может быть использована концентрация до 8 M): некоторые белки в изоэлектрической точке выпадают в осадок, в этом случае для того, чтобы белок оставался в растворе в гель вводится мочевина; при использовании мочевины следует применять только свежие её растворы, чтобы не допустить карбамоилирования белка;
- использование альтернативных способов окрашивания;
- использования добавок для геля, таких как неионные детергенты (например, октилглюкозид) или цвиттерионные детергенты (например, CHAPS или CHAPSO), и добавление амфолита к образцу для предотвращения процессов агрегации и преципитации белков.
ПОЛОЖЕНИЯ, КОТОРЫЕ СЛЕДУЕТ ПРИНИМАТЬ ВО ВНИМАНИЕ, ИСПОЛЬЗУЯ ДАННЫЙ МЕТОД
Образцы могут наноситься на любой участок поверхности геля, но для того, чтобы защитить белки от экстремальных величин рН, образцы не должны наносится в непосредственной близости от электродов. В ходе выполнения анализа аналитик может нанести белок на гель в трёх местах (посередине и на обоих концах). Образцы белка, наносимые на противоположные концы геля, могут быть различными.
Известно явление, называемое катодным дрейфом, при котором градиент рН с течением времени разрушается. Это может происходить, если фокусирование в геле происходит слишком долго. Причины данного явления не совсем ясны, но факторами, вызывающими катодный дрейф, могут быть электроэндоосмос и абсорбция диоксида углерода. Для исследования этой проблемы могут быть использованы фиксированные градиенты рН.
В течение фокусирования важно проводить эффективное охлаждение (приблизительно 4°C) ёмкости, в которую помещён гель. Высокие напряжённости электрического поля, используемые во время изоэлектрического фокусирования, могут приводить к перегреванию и влиять на качество фокусируемого геля.
2.3. ПОДЛИННОСТЬ (ИДЕНТИФИКАЦИЯ)
2.3.1. РЕАКЦИИ ПОДЛИННОСТИ (ИДЕНТИФИКАЦИИ) НА ИОНЫ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ
АЛКАЛОИДЫ
Несколько миллиграммов или указанное в частной статье количество испытуемого образца растворяют в 5 мл воды Р, прибавляют кислоту хлористоводородную разведенную Р до кислой реакции раствора (2.2.4), затем 1 мл раствора калия йодвисмутата Р, тотчас образуется оранжевый или оранжево-красный осадок.
АЛЮМИНИЙ
Около 15 мг испытуемого образца растворяют в 2 мл воды Р. К полученному раствору или к 2 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют 0,5 мл кислоты хлористоводородной разведенной Р и около 0,5 мл реактива тиоацетамида Р; осадок не образуется. Затем прибавляют по каплям раствор натрия гидроксида разведенный Р; образуется гелеобразный белый осадок, растворяющийся при последующем прибавлении раствора натрия гидроксида разведенного Р. К полученному раствору постепенно прибавляют раствор аммония хлорида Р, вновь образуется гелеобразный белый осадок.
АМИНЫ АРОМАТИЧЕСКИЕ ПЕРВИЧНЫЕ
Испытуемый раствор, указанный в частной статье, подкисляют кислотой хлористоводородной разведенной Р, или 0,05 г испытуемого образца растворяют в кислоте хлористоводородной разведенной Р образца прибавляют 0,2 мл раствора натрия нитрита Р и через 1-2 мин прибавляют полученный раствор к 1 мл раствора /3-нафтола Р; появляется интенсивно оранжевое или красное окрашивание и, как правило, образуется осадок такого же цвета.
АММОНИЯ СОЛИ
К испытуемому раствору, указанному в частной статье, прибавляют 0,2 г магния оксида Р. Через жидкость пропускают воздух и выходящий воздух направляют в смесь 1 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и 0,05 мл раствора метилового красного Р; окраска индикатора переходит в желтую. Затем прибавляют 1 мл свежеприготовленного раствора 100 г/л натрия кобальтинитрита Р; образуется желтый осадок.
АММОНИЯ СОЛИ И СОЛИ ЛЕТУЧИХ ОСНОВАНИЙ
Около 20 мг испытуемоого образца растворяют в 2 мл воды Р. К полученному раствору или к 2 мл раствора, указанного в частной статье, прибавляют 2 мл раствора натрия гидроксида разведенного Р. При нагревании раствора выделяются пары аммиака, которые обнаруживаются по запаху и щелочной реакции (2.2.4).
АЦЕТАТЫ
